NGS配套方案
來源：本站 作者：admin 時間：2019/1/15
NGS配套方案
前言
高通量測序技術(shù)（又稱二代測序技術(shù)）是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，有些文獻(xiàn)中稱其為下一代測序技術(shù)（next generation sequencing）。高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。目前高通量測序平臺的代表是Illumina、ABI。
二代測序經(jīng)典路線大致如下： 得到初始樣本（Retsch冷凍研磨樣本制備系統(tǒng)+耶拿C16核酸抽提系統(tǒng)）→初始樣本質(zhì)控與定量（NanoDrop One超微量分光光度計或Bio-Tek Epoch分光光度計+Qubit 3.0）→初始樣本片段化（Covaris M220或Bioruptor）→ Fragment Clean up、加接頭或建庫過程中的液體處理（Caliper自動化工作站：Zephyr或Sciclone NGS）→特定大小片段回收、去除接頭（Blue Pippin）→文庫質(zhì)控及 定量（Qsep1）→PCR擴(kuò)增（耶拿TAdvanced SG PCR儀）→測序及生物信息學(xué)組裝/分析（Partek Genomics Suite）
具體方案如下：
一、 樣本處理
冷凍混合研磨儀MM400
冷凍混合研磨儀MM400的研磨罐在水平方向上進(jìn)行圓弧式徑向振動。罐內(nèi)的球體由于其慣性作用對位于光滑的研磨罐內(nèi)額壁上的樣品進(jìn)行帶有高能量的撞擊，并以此粉碎樣品。研磨罐的轉(zhuǎn)動加上研磨球的運(yùn)動對樣品產(chǎn)生了高強(qiáng)度的混合作用。通過使用多個小球甚至可以進(jìn)一步的提高混合的效果。當(dāng)使用很多個小球時（如玻璃球），生物細(xì)胞就可以被破碎了。球與球之間的摩擦撞擊作用可以有效導(dǎo)致細(xì)胞的破碎。
冷凍混合研磨儀MM400應(yīng)用實例
纖維組織、骨頭、頭發(fā)、化學(xué)品、藥丸、藥材、藥片、礦物質(zhì)、金屬礦石、合金、玻璃、陶瓷、土壤、污泥、植物組織、谷物顆粒、油籽料、合成材料、廢料樣品、毛料、塑料、RoHS樣品以及紡織品等。
二、 核酸提取
全自動核酸提取儀InnuPure C16 touch
智能：人性化試劑盒設(shè)計
預(yù)裝封膜試劑條/板，一次可同時提取1-16個樣品。所有試劑盒都是即用型，日常操作非常簡單省時。試劑盒無需分裝，節(jié)省大量分液時間，最大限度減少人工操作。預(yù)裝試劑也避免了人工分裝可能出現(xiàn)的錯加/漏加，加樣過程中因多加而導(dǎo)致的溢液污染。同時試劑盒中包括提取所需的全部試劑/耗材和預(yù)裝試劑，無需您額外購買。
歷史：25年以上的高精度移液經(jīng)驗
可靠性：有效避免交叉污染
獨特優(yōu)勢：移液頭穿孔功能，避免了撕膜帶來的試劑間污染
1ml帶濾芯的槍頭，避免了移液頭和樣品之間的污染
預(yù)裝封膜的試劑，避免了試劑分裝的污染
UV燈滅菌，有效消除批次間樣品的污染
運(yùn)行時儀器前門完全封閉，阻隔外部環(huán)境污染
三、 DNA質(zhì)控
此款符合人體工程學(xué)的獨立式分光光度計具有高分辨率和觸摸屏界面設(shè)計，使您離研究目標(biāo)更進(jìn)一步。 強(qiáng)大的自動調(diào) 節(jié)光程技術(shù)有助于準(zhǔn)確測量濃縮樣品而無需稀釋。
Acclaro 樣品智能技術(shù)
Acclaro 技術(shù)可以在提供準(zhǔn)確的定量測定的同時，增強(qiáng)用戶對樣品質(zhì)量的了解。 對污染物的早期鑒別能夠避免下游應(yīng)用的失敗，從而節(jié)省故障排除的時間。
在數(shù)秒內(nèi)驗證樣品結(jié)果 - 鑒別樣品污染物并獲得矯正的濃度結(jié)果。
通過警報獲取信息 – 通過提供相應(yīng)的技術(shù)支持和解決問題向?qū)В瑥亩@得樣品質(zhì)量的即時反饋。
依靠準(zhǔn)確結(jié)果——采用嵌入式傳感器和數(shù)字影像分析技術(shù)，確保測量完整性。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 特點
同時包含基座和比色皿檢測模塊，以擴(kuò)展實驗靈活性和擴(kuò)大動態(tài)范圍。
測量稀釋樣品，執(zhí)行動力學(xué)實驗并獲取細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度測量結(jié)果。
比色皿檢測模塊包括溫度控制和攪拌區(qū)域。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 增強(qiáng)功能
符合人體工程學(xué)的獨立式設(shè)計 – 集成 Android? 平板而無需單獨的計算機(jī)，能夠通過無線網(wǎng)絡(luò)*、以太網(wǎng)或 USB 實現(xiàn)數(shù)據(jù)的無縫傳輸。
自動測量與自動調(diào)零功能 –降下檢測臂即可實現(xiàn)即時測量，以此簡化多樣品處理流程。 僅需觸摸一下屏幕，即可實現(xiàn)這些功能的“開”或“關(guān)”。
更廣的動態(tài)范圍——采用自動調(diào)節(jié)光程技術(shù)，無需對高濃度樣品（dsDNA 高達(dá) 27,500 ug/μL）進(jìn)行稀釋
集成式學(xué)習(xí)中心——僅需指尖滑動，即可瀏覽經(jīng)存檔的技術(shù)支持文檔與教學(xué)動畫。
四、 DNA定量
Qubit® 熒光定量儀
與傳統(tǒng)紫外分光法不同，Qubit®3.0采用專門的熒光檢測技術(shù)和染料，特異性的區(qū)分出DNA，RNA，降解核酸，游離核苷酸及蛋白質(zhì)，即便在低濃度下也具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。
選擇性——采用熒光染料，特異識別并定量dsDNA， oligos，RNA，microRNA
準(zhǔn)確——比傳統(tǒng)紫外分光光度計更加準(zhǔn)確
靈敏——最低檢測1uL樣品，準(zhǔn)確定量濃度僅為10 pg/uL 的DNA和12.5 ug/mL的蛋白
簡單——易于使用的觸摸屏界面和Android系統(tǒng)，全新的雙核處理器加快計算速度
五、 DNA片段化
Covaris
M220自動聚焦聲波基因組剪切儀
自動聲波聚焦（Adaptive Focused Acoustic?, AFA)技術(shù) ，是將高速發(fā)展的醫(yī)用超聲顯像診斷（低強(qiáng)度聚焦超聲）與體外震波碎石治療（高強(qiáng)度聚焦超聲）的技術(shù)優(yōu)勢結(jié)合起來，并與先進(jìn)的微處理器及機(jī)器控制結(jié)合起來，可以應(yīng)用在多種生命科學(xué)研究中。AFA技術(shù)原理實質(zhì)上是一個受控的液體空腔化的動力學(xué)過程，簡單可理解為：當(dāng)聲波通過液體時，產(chǎn)生的微小氣泡迅速膨脹，隨后由于液體迅速返回空穴導(dǎo)致氣泡崩潰，從而產(chǎn)生液流剪切力，Covaris AFA技術(shù)就是通過控制這種氣穴作用來控制剪切力，即成百上千個空化氣泡的累加作用，產(chǎn)生的液流沖擊力>100m/sec，AFA技術(shù)即通過計算機(jī)控制和儀器及耗材各部分的精確設(shè)計，從而控制作用在樣本上的剪切力將核酸剪切到目的大小。（如下簡圖）
空氣氣泡 氣泡崩潰產(chǎn)生液流剪切力
二代測序應(yīng)用領(lǐng)域：
還沒有參考序列的物種：在基因組水平上進(jìn)行重頭測序（de novo sequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；
有參考序列的物種：進(jìn)行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。
轉(zhuǎn)錄組水平：進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序（whole transcriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究；
轉(zhuǎn)錄組水平：與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。
小分子RNA測序（small RNA sequencing）：通過分離特定大小的RNA分子進(jìn)行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。
二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)（Targeted Resequencing）。這項技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進(jìn)行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測序?？茖W(xué)家們目前認(rèn)為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。
目前，外顯子組測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。
以上領(lǐng)域的測序都需要進(jìn)行核酸片段化，M220是目前最主要的片段化工具。
六、 PCR擴(kuò)增
Biometra TAdvanced 96 PCR儀
有鍍金純銀樣品槽、金色合金等多種樣品模塊可選，實現(xiàn)高效傳熱品槽通量靈活，有96孔、60孔、384孔等，模塊可更換精準(zhǔn)的溫度控制：通過智能的溫度控制系統(tǒng)RAC實現(xiàn)快速的升降溫變化、優(yōu)異的溫度準(zhǔn)確性和均一性，以及高度的重復(fù)性線性溫度梯度工具（LGT）：實現(xiàn)準(zhǔn)確的溫度梯度設(shè)置和控制，極大地方便了退火溫度的優(yōu)化（帶溫度梯度的型號）高性能智能熱蓋（HPSL）：深凹的熱蓋設(shè)計可有效地將熱量控制在熱蓋內(nèi)，防蒸發(fā)效果極佳靜音技術(shù)（WQT）：運(yùn)行時非常安靜，無噪音，提供舒適的工作環(huán)境巧妙的散熱設(shè)計：通過儀器后部和底部進(jìn)行高效散熱，儀器旁邊可放置其他儀器，節(jié)省實驗室空間儀器自檢功能：可進(jìn)行自動的檢測診斷，提供各種運(yùn)行和故障信息
七、 RNA樣本質(zhì)量控制
Bioptic Qsep1生物分析儀
Qsep1生物分析儀是一款便攜式毛細(xì)管電泳儀，基于毛細(xì)管電泳中待測樣品在電場作用下離子遷移速度不同而對組分進(jìn)行分離和分析的原理，克服傳統(tǒng)凝膠電泳實驗耗時耗力有污染等弊端而研發(fā)的一款高性能的全自動化毛細(xì)管核酸分析儀。它既可用于電泳分離，同時對每一個片段的大小進(jìn)行精確測定和濃度定量。
Qsep1生物分析儀的操作系統(tǒng)非常簡便，簡化了繁復(fù)的操作與流程，能讓一般用戶在5分鐘內(nèi)學(xué)會操作系統(tǒng)，1分鐘分析樣品得出結(jié)果。它將傳統(tǒng)實驗室的多個繁雜步驟：包含樣品準(zhǔn)備、配膠、點樣、跑膠、拍照及結(jié)果判讀，整合簡化為單一步驟。使用可拋棄式卡夾，使復(fù)雜的生物樣本分析以快速、精確、低成本的方式得以實現(xiàn)。其高通量、高分辨率、高靈敏度、全自動、標(biāo)準(zhǔn)化、無污染的特點賦予了其強(qiáng)大的檢測分析功能。
Qsep1生物分析儀可代替?zhèn)鹘y(tǒng)凝膠電泳，適用于分子生物學(xué)實驗室、教學(xué)實驗室、快速檢測中心、戶外檢測等需要快速出結(jié)果、樣本量少的實驗室。
產(chǎn)品特點：
Qsep1生物分析儀，采用可拋棄式的預(yù)制膠卡夾，即插即用，全自動進(jìn)樣，無須人工制膠、灌膠、上樣，免去了手工制膠的繁瑣和人工上樣的 誤差，可用于核酸質(zhì)控和PCR產(chǎn)物電泳，分辨率高，重復(fù)性好，可處理1-8個任意個數(shù)樣本，真正實現(xiàn)了核酸片段和蛋白的快速、自動化、高通量、高分辨率 分析。
全自動進(jìn)樣：自動分析1-8個樣本
拋棄式卡夾：無需制膠，灌膠，每支卡夾可分析100-300樣品（DNA,RNA和Protein）
快速分析：可達(dá)1分鐘內(nèi)/樣品
高靈敏度：可達(dá)pg級
高分辨率：最佳可達(dá)1-4bp
結(jié)果呈現(xiàn)：數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)，凝膠成像圖，毛細(xì)管電泳圖
軟件分析：同時進(jìn)行定性及定量分析，界面友好，操作人性化
樣品需求和消耗：最低樣品需求量1μL，上樣量小于0.1μL
低成本：市場上最經(jīng)濟(jì)的儀器和耗材費用
應(yīng)用：
?遺傳分析 ?限制片段長度多態(tài)性分析 (RFLP)
?PCR 產(chǎn)物檢測 ?質(zhì)粒DNA酶切，構(gòu)造及純度分析
?Genomic DNA & NGS 質(zhì)控 ?高分辨率多重PCR分析
?DNA 引物質(zhì)控（Primer QC) ?STR/微衛(wèi)星（SSR）
?總RNA，cRNA，片段化RNA，micro-RNA質(zhì)控 ?合成寡核苷酸片段分析
八、 樣本定量
熒光定量基因擴(kuò)增儀qTOWER3
來自德國耶拿的全新一代熒光定量基因擴(kuò)增儀qTOWER3 touch系列，采用獨特的4個高效LED固態(tài)光源作為激發(fā)光源，并通過專利性的光纖掃描系統(tǒng)來采集熒光信號，確保市面上常用的熒光定量PCR染料都能得到出色穩(wěn)定的激發(fā)和檢測。靈活的檢測通道配置，升級方便，最高可實現(xiàn)六重目的基因的同時檢測。耶拿公司具有近三十年的基因擴(kuò)增儀研發(fā)制造歷史，快速且耐用的鍍金純銀樣品槽使其96孔溫度均一性達(dá)到± 0.15 ℃。選配的12列線性溫度梯度功能使用戶能快速確定最佳的PCR退火溫度進(jìn)而優(yōu)化反應(yīng)條件，是用戶優(yōu)化PCR程序的得力助手。用戶可以選擇用電腦來操控儀器，也可以選擇用彩色觸摸屏來操控儀器。它具有開放的試劑和耗材系統(tǒng)，適用于標(biāo)準(zhǔn)的96孔PCR板、8聯(lián)管或者PCR單管。
快速反應(yīng)：
鍍金純銀樣品槽，最大升溫速率為8℃/s，熱導(dǎo)性好，且耐腐蝕抗氧化
精準(zhǔn)控溫：
溫度準(zhǔn)確性為±0.1 ℃，96孔的溫度均一性為±0.15 ℃，精準(zhǔn)的溫度控制帶來穩(wěn)定且特異性好的擴(kuò)增效果
線性溫度梯度：
獨特的12列線性溫度梯度功能，能幫助用戶快速找到最精準(zhǔn)的退火溫度
自動熱蓋：
采用先進(jìn)的自動熱蓋技術(shù)，儀器自動控制熱蓋的壓力，確保有效的防蒸發(fā)效果
耗材開放：
對耗材沒有特殊要求，用戶可自由選擇96孔板、8聯(lián)管或單管，使用方便
高強(qiáng)度寬光譜的激發(fā)光源：
采用藍(lán)色、綠色、紅色、白色（RGBW）四個高強(qiáng)度長壽命LED固態(tài)光源，確保在整個光譜檢測范圍內(nèi)都有很強(qiáng)的光強(qiáng)，提高檢測靈敏度，而且不發(fā)熱，使用壽命長，終身免維護(hù)
高靈敏度檢測器：
最新型的通道式光電倍增管檢測器，檢測靈敏度更高
快速掃描檢測：
8道光纖掃描檢測快速，即使完成六通道的96孔掃描，也只需要6s
無需光路校正：
掃描檢測能確保每孔的信號激發(fā)和檢測光程都完全一致，無需光路校正，因此無需額外占用一個校正通道，可實現(xiàn)真正的六通道基因檢測
檢測通道配置靈活：
用戶可根據(jù)需求靈活選擇通道數(shù)和各通道的檢測濾光片組, 有12種不同波長的濾光片組可選擇以配置成1-6通道的檢測系統(tǒng)，包括濾光片錯配的FRET檢測組合和專用于蛋白熔解曲線分析的濾光片組，覆蓋從藍(lán)光到紅光的全光譜，通道數(shù)可以隨時方便升級，以滿足未來更多的檢測需求
九、 片段回收
Blue Pippin全自動核酸片段回收系統(tǒng)
Blue Pippin
回收的片段范圍：50bp－50kp
樣品通量：1－5個樣品
回收效率：50－80％
創(chuàng)新的技術(shù)
Pippin Prep系統(tǒng)包括一次性的5泳道預(yù)制膠電泳槽，一個帶有DNA熒光檢測光路單元(非紫外)的電泳平臺。
運(yùn)行中，軟件通過實時光路檢測，和參考泳道中的DNA ladder進(jìn)行比對，確定已經(jīng)設(shè)置回收長度范圍的DNA片段到達(dá)洗提泳道(elution channel)的準(zhǔn)確時間
通過電極切換，打開洗提泳道，使目標(biāo)片段進(jìn)入洗提通道的回收室中，從而實現(xiàn)回收。然后電極再次切換，洗提泳道關(guān)閉，剩余的DNA分子進(jìn)入原先的分離泳道(separation channel)。
自動化核酸片段回收 VS傳統(tǒng)切膠回收
手工切膠回收Pippin Prep/Blue Pippin 幾個小時的手工操作 幾分鐘的手工操作 回收的核酸片段大小不精確 精確回收指定大小范圍的核酸片段 存在小分子量（LMW）污染 去除小分子量（LMW）污染 30-50％的回收效率 50-80％的回收效率 回收中、小核酸片段 可以回收大的核酸片段
應(yīng)用范圍
下一代測序，亞克隆，轉(zhuǎn)基因等等
小分子量或者大分子量的核酸片段回收
大小很近的核酸片段的區(qū)分回收
珍貴的微量樣品中的核酸片段回收
